結(jié)合工作實踐，對微生物限度檢查方法驗證過程中的問題進行分析，并提出合理化建議，以使驗證方法能保證污染供試品的微生物被充分檢出。

　　為使微生物限度檢查方法更加科學、完整，2005年版《中國藥典》規(guī)定：在建立供試品的微生物限度檢查法或檢查法的檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，應(yīng)對檢查法的可靠性進行方法驗證，，在其供試品3次獨立的平行試驗中，細菌、霉菌及酵母菌的回 收率均應(yīng)達70%以上，控制菌檢查方法驗證的試驗組應(yīng)檢出試驗菌，陰性菌對照組不得檢出，否則不符合驗證試驗要求，應(yīng)建立新方法并重新驗證。但方法驗證周期長，程序煩瑣，干擾因素多，若控制不當則難以達到標準要求。影響微生物限度檢查方法驗證結(jié)果有哪些因素？現(xiàn)就方法驗證過程中易影響結(jié)果的幾個原因分析如下。

　　1、藥品的抑菌或殺菌性成分

　　筆者在口服中成藥和西藥的微生物限度檢查中發(fā)現(xiàn)，相當多的品種(如三黃片、牛黃解毒片、阿加盼散、維生素B2片等)具有抑菌作用，其微生物限度檢驗結(jié)果是否準確，主要取決于供試品本身在試驗條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖。在檢驗前或檢驗過程中，應(yīng)排除其抑菌作用，使之不干擾微生物限度檢查，這樣所得結(jié)果才有效。

　　對于供試藥品的抑菌性，國外藥典規(guī)定在檢查前先通過試驗加以確定，并對供試品進行處理，消除抑菌作用影響后再進行檢查。在我國藥典中，供試藥品的抑菌性是根據(jù)不同稀釋度的菌數(shù)變化和控制菌的陽性對照試驗是否正常生長來判斷的。 在試驗中，低稀釋級抑制菌不生長或少生長而高稀釋級才生長的情況并不少見，這給方法驗證帶來了難度。

　　2005年版《中國藥典》的方法驗證一般是采用最低稀釋級的供試液對規(guī)定菌株進行逐一驗證，但若抑菌作用未消除或消除不完全，其回收率就很難達到要求。因此，在方法驗證前判定供試藥品是否存在抑菌或殺菌性是方法驗證是否成功的關(guān)鍵因素之一。在試驗前應(yīng)先對供試藥品處方進行分析，然后作預(yù)試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果采用最簡單、最易操作的方法進行驗證。如選擇標準上所規(guī)定的方法消除最低稀釋級的供試液的抑菌活性，仍不能使試驗菌的回收率達到方法驗證的要求時，應(yīng)根據(jù)供試品的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，采用高一級稀釋供試液重新進行回收率測定，當試驗菌的回收率達到計數(shù)方法驗證的要求時，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液。

　　2、標準菌株的保存及菌液的制備、貯期

　　藥品微生物限度檢查對象具有以下特征：屬能繁殖的活細胞生物，活性易變性;數(shù)量少且分布不均勻;多數(shù)處于受損狀態(tài);生存 環(huán)境具多樣性及復雜性。驗證試驗中使用的標準菌株形態(tài)變異、 菌落變異、耐藥性變異等均可使細菌叢集或分散不均，從而造成計數(shù)誤差大，影響驗證結(jié)果。

　　因此，在方法驗證中所采用的標準菌株其生物學特性必須典型、穩(wěn)定，對試驗菌種的保存，應(yīng)采用適宜的方法和技術(shù)，以防試驗菌株變異，所用菌種的傳代次數(shù)按規(guī)定不得超過5代，所制備的菌液貯期不能太長，菌數(shù)應(yīng)達到藥典要求。

　　3、操作環(huán)境不符合規(guī)定

　　按微生物限度檢查要求，無菌室應(yīng)由無菌操作間和兩個緩沖間組成，操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞箱，操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對，每個無菌室應(yīng)有獨立的空氣凈化系統(tǒng);環(huán)境潔凈度不應(yīng) 低于10000級，其操作點或凈化工作臺的凈化級別應(yīng)達到100級。 筆者曾發(fā)現(xiàn)，在凈化工作臺啟動的情況下，有3批同一樣品在驗證試驗中回收率重現(xiàn)性差，后經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)是凈化工作臺不合格造成 的。因此，應(yīng)加強無菌室的清潔、維護和保養(yǎng)工作，定期檢測元菌操作臺及凈化工作臺的潔凈度，對不合格者應(yīng)及時處理。

　　4、操作誤差

　　操作不熟練，實驗環(huán)節(jié)控制不嚴格，或?qū)嶒灢僮鞑粔驀乐?，均會給試驗結(jié)果帶來很大影響。如放供試液或菌液入皿時每1 mL未完全放盡;所加菌液計數(shù)不準確;在驗證細菌、霉茵及酵母菌計數(shù) 方法時，樣品及菌液注皿后未立即傾注培養(yǎng)基，由于樣品的活性作用造成前面的平皿與后面的平皿的細菌誤差大。

　　因此，在操作中， 所取制備菌液的單位體積菌數(shù)比標準規(guī)定的要稍高些，以減少加在樣品中的菌液體積。應(yīng)將0.4-0.6mL菌液加在平皿中部，避免其流動，然后立即加入培養(yǎng)基，最好有兩人操作，以減少皿與皿間的試驗菌數(shù)誤差。

　　5、培養(yǎng)基靈敏度下降

　　為了方便，很多單位在試驗中都使用干粉培養(yǎng)基，但干粉培養(yǎng)基極易吸潮，存放不當會出現(xiàn)凝塊，使凝固性變差，所以，要注意干粉培養(yǎng)基的貯存和保管。用電爐直火加熱熔化培養(yǎng)基或?qū)⑹Ｓ嗟?培養(yǎng)基冷藏后再熔化使用，均很容易破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，并直接影響菌回收率。

　　6、滅菌方法不當

　　高壓消毒滅菌法是最常用、最有效的滅菌方法。為了保證高壓滅菌的質(zhì)量，達到高壓消毒的目的，在進行高壓滅菌消毒時，首先要選擇合格的壓力蒸氣滅菌器，其次操作人員必須了解滅菌器的原理并遵守其操作規(guī)程，選擇經(jīng)驗證合格的滅菌程序。消毒時要特別注意排盡鍋內(nèi)的冷空氣，否則壓力雖然達到了要求，溫度卻達不到要求，滅菌就可能不徹底。

　　同時，應(yīng)根據(jù)消毒物品的特性確定合理的滅菌時間和溫度： 一般情況下，含有糖分的培養(yǎng)基溫度須控制在 115℃，保持15-20min：不含糖分的培養(yǎng)基溫度應(yīng)控制在121℃， 保持15-20min;而含菌的培養(yǎng)基(使用過的)溫度須控制在121℃， 保持30min左右。每次使用時，都應(yīng)有必要的監(jiān)視指標。

　　7、菌落計數(shù)誤差

　　在方法驗證中，對試驗菌組的菌落計數(shù)應(yīng)仔細觀察，對供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等要嚴格區(qū)分，對可影響計數(shù)的供試品， 在進行方法驗證前，應(yīng)先將對結(jié)果有影響的藥渣除掉。

　　總之，對藥品的微生物限度檢查，應(yīng)采用經(jīng)過驗證的方法，且操作者須有一定的理論和實踐經(jīng)驗，嚴格按操作規(guī)范進行，這樣才能減少或避免對方法驗證結(jié)果造成的誤差。